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發酵工藝控制――氧對發酵的影響及控制

2016-07-12 09:16:13車邦

在好氧深層培養中aaaaa,氧氣的供應往往是發酵能否成功的重要限制因素之一aaaaa。通氣效率的改進可減少空氣的使用量aaaa,從而減少泡沫的形成和雜菌污染的機會aaaa。
一、溶解氧對發酵的影響
溶氧是需氧發酵控制最重要的參數之一aaaa。由於氧在水中的溶解度很小aaa,在發酵液中的溶解度亦如此aaa,因此aaaaa,需要不斷通風和攪拌aaaaa,才能滿足不同發酵過程對氧的需求aaaaa。溶氧的大小對菌體生長和產物的形成及產量都會產生不同的影響aaa。如穀氨酸發酵aaaaa,供氧不足時aaaa,穀氨酸積累就會明顯降低aaaa,產生大量乳酸和琥珀酸aaaaa。
需氧發酵並不是溶氧愈大愈好aaa。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成aaaaa,但溶氧太大有時反而抑制產物的形成aaaaa。因爲aaa,爲避免發酵處於限氧條件下aaaaa,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度aaa,並使發酵過程保持在最適濃度aaaaa。最適溶氧濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關aaaa,這是由實驗來確定的aaaaa。根據發酵需氧要求不同可分爲三類:第一類有穀氨酸、谷氨醯胺、精氨酸和脯氨酸等穀氨酸系氨基酸aaa,它們在菌體呼吸充足的條件下aaa,產量才最大aaaa,如果供氧不足aaaa,氨基酸合成就會受到強烈的抑制aaa,大量積累乳酸和琥珀酸aaaaa;第二類aaaa,包括異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸aaa,即天冬氨酸系氨基酸aaaa,供氧充足可得最高產量aaaa,但供氧受限aaaaa,產量受影響並不明顯aaa;第三類aaa,有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸aaa,僅在供氧受限、細胞呼吸受抑制時aaa,才能獲得最大量的氨基酸aaaa,如果供氧充足aaaaa,產物形成反而受到抑制aaa。
氨基酸合成的需氧程度產生上述差別的原因aaaa,是由它們的生物合成途徑不同所引起的aaa,不同的代謝途徑產生不同數量的NAD(P)Haaa,當然再氧化所需要的溶氧量也不同aaa。第一類氨基酸是經過乙醛酸循環和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統兩個途徑形成的aaaaa,產生的NADH量最多aaaa。因此NADH氧化再生的需氧量爲最多aaa,供氧愈多aaa,合成氨基酸當然亦愈順利aaa。第二類的合成途徑是產生NADH的乙醛酸循環或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統aaa,產生的NADH量不多aaaaa,因而與供氧量關係不明顯aaa。第三類aaa,如苯丙氨酸的合成aaa,並不經TCA循環aaaaa,NADH產量很少aaa,過量供氧aaaaa,反而起到抑制作用aaaaa。肌苷發酵也有類似的結果aaaaa。由此可知aaa,供氧大小是與產物的生物合成途徑有關
aaaa。
在抗生素髮酵過程中aaaaa,菌體的生長階段和產物合成階段都有一個臨界氧濃度aaaa,分別爲C臨′和C臨aaa。兩者的關係有:①大致相同aaaaa;②C臨′C臨③C臨′C臨aaaaa。
二、微生物對氧的需求
好氧微生物生長和代謝均需要氧氣aaa,因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要aaaa,在不同的環境條件下aaaa,各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的aaaa。
微生物的吸氧量常用呼吸強度和攝氧率兩種方法來表示aaa,呼吸強度是指單位質量的幹菌體在單位時間內所吸取的氧量aaa,以QO2aaa,表示aaaa,單位爲mmolO2/(g幹菌體•h)aaa。當氧成爲限制性條件時aaaaa,比耗氧速率爲:
QO2=(QO2)mCL/(K0+CL)
(QO2)m --------最大比耗氧速度,mol /(kg.s)
K0 --------氧的米氏常數,mol /m3
CL---------- 溶解氧的濃度aaaaa, mol /m3
攝氧率是指單位體積培養液在單位時間內的耗氧量aaa,以r表示aaaa,單位爲mmolO2/(L•h)aaaaa。呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量aaaa,但是aaa,當培養液中有固體成分存在時aaaaa,對測定有困難aaaa,這時可用攝氧率來表示aaaa。微生物在發酵過程中的攝氧率取決於微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度aaaaa。
微生物的比耗氧速率的大小受多種因素影響aaaa,當培養基中不存在其他限制性基質時aaaa,比耗氧速率隨溶氧濃度增加而增加aaaa,直至某一點aaa,比耗氧速率不再隨溶氧濃度的增加而增加aaaaa,此時的溶氧濃度稱爲呼吸臨界氧濃度(criticaloxygenconcentrationOf respiration)aaaa,以Ccr表示aaa。呼吸臨界溶氧濃度一般指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度aaa,如對產物形成而言便稱爲產物合成的呼吸臨界氧濃度aaa。
當不存在其他限制性基質時aaa,溶解氧濃度高於臨界值aaa,細胞的比耗氧速率保持恆定aaa;在臨界氧濃度以下aaa,微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降aaaaa,細胞處於半厭氣狀態aaa,代謝活動受到阻礙aaaaa。培養液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡aaa,才能滿足微生物對氧的利用aaa。
由此可知aaaa,只有使溶氧濃度大於其臨界氧濃度時aaa,才能維持菌體的最大的比耗氧速率aaaaa,以使菌體得到最大的合成量aaa。但由於發酵的目的是爲了得到發酵的產物aaaaa,因此aaaa,由氧飢餓而引起的細胞代謝干擾aaaaa,可能對形成某些產物是有利的aaa。所以aaaa,需氧發酵並不是溶氧愈大愈好aaaaa。即使是一些專性好氧菌aaaa,過高的溶氧對生長可能不利aaaa。氧的有害作用是通過形成新生Oaaaa,超氧化物基O2-和過氧化物基O22-或羥基自由基OH-aaa,破壞許多細胞組分體現的aaa。有些帶巰基的酶對高濃度的氧敏感aaa,好氣微生物曾發展一些機制aaa,如形成觸酶aaaa,過氧化物酶和超氧化物歧化酶aaaaa,使其免遭氧的摧毀aaa。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成aaa,溶氧太大有時反而抑制產物的形成aaa。爲避免發酵處於限氧條件下aaa,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度aaa,並使發酵過程保持在最適濃度aaaa。最適濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關aaa,這是由實驗來確定的aaa。發酵生產中aaaaa,供氧的多少應根據不同的菌種、發酵條件和發酵階段等具體情況決定aaaa。
例如穀氨酸發酵在菌體生長期aaa,希望糖的消耗最大限度地用於合成菌體aaa,而在穀氨酸生成期aaa,則希望糖的消耗最大限度地用於合成穀氨酸aaaaa。因此aaa,在菌體生長期aaaaa,供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量aaaaa,即r=Qo2c(X)aaa,若菌體的需氧量得不到滿足aaaa,則菌體呼吸受到抑制aaaaa,而抑制生長aaa,引起乳酸等副產物的積累aaaaa,菌體收率降低aaa。但是供氧並非越大越好aaa,當供氧滿足菌體需要aaa,菌體的生長速率達最大值aaaaa,如果再提高供氧aaaaa,不但不能促進生長aaaa,造成浪費aaa,而且由於高氧水平抑制生長aaaa。同時高氧水平下生長的菌體不能有效地產生穀氨酸aaaaa。
三、影響微生物需氧量的因素
在需氧微生物發酵過程中影響微生物需氧量的因素很多aaaa,除了和菌體本身的遺轉特性有關外aaaaa,還和下列一些因素有關:
1.培養基
培養基的成分和濃度對產生菌的需氧量的影響是顯著的aaa。培養基中碳源的種類和濃度對微生物的需氧量的影響尤其顯著aaaa。一般來說aaaaa,碳源在一定範圍內aaaa,需氧量隨碳源濃度的增加而增加aaaa。在補料分批發酵過程中aaaa,菌種的需氧量隨補入的碳源濃度而變化aaa,一般補料後aaaaa,攝氧率均呈現不同程度的增大aaa。
2、菌齡及細胞濃度
不同的生產菌種aaa,其需氧量各異aaaaa。同一菌種的不同生長階段aaaa,其需氧量也不同aaaaa。―般說aaaaa,菌體處於對數生長階段的呼吸強度較高aaa,生長階段的攝氧率大於產物合成期的攝氧率aaaa。在分批發酵過程中aaaaa,攝氧率在對數期後期達到最大值aaaaa。因此認爲培養液的攝氧率達最高時aaa,表明培養液中菌體濃度達到了最大值aaaa。
3、培養液中溶解氧濃度的影響
在發酵過程中aaa,培養液中的溶解氧濃度(CL)高於菌體生長的臨界氧濃度(C長臨)時aaaaa,菌體的呼吸就不受影響aaaaa,菌體的各種代謝活動不受干擾aaaaa;如果培養液中的CL低於C長臨時aaaaa,菌體的多種生化代謝就要受到影響aaaa,嚴重時會產生不可逆的抑制菌體生長和產物合成的現象aaaaa。
4、培養條件
若干實驗表明aaaa,微生物呼吸強度的臨界值除受到培養基組成的影響外aaaa,還與培養液的pH、溫度等培養條件相關aaaaa。一般說aaaa,溫度愈高aaaaa,營養成分愈豐富aaaaa,其呼吸強度的臨界值也相應增高aaa。
5、有毒產物的形成及積累
在發酵過程中aaaa,有時會產生一些對菌體生長有毒性的如CO2等代謝產物aaa,如不能及時從培養液中排除aaa,勢必影響菌體的呼吸aaaa,進而影響菌體的代謝活動aaaaa。
6、揮發性中間產物的損失
在糖代謝過程中aaaaa,有時會產生一些揮發性的有機酸aaaaa,它們隨着大量通氣而損失aaa,從而影響菌體的呼吸代謝aaa。
四、氧在發酵液中的傳遞
1、氧的傳遞阻力
在需氧發酵過程中aaaa,氣態氧必須先溶解於培養基中aaa,然後纔可能傳遞至細胞表面aaa,再經過簡單的擴散作用進入細胞內的呼吸酶的位置上而被利用aaaa,參與菌體內的氧化等生物化學反應aaaaa。氧的這一系列傳遞過程需要克服供氧方面和需氧方面的各種阻力才能完成aaaa。
2、氧的傳遞方程式
(1)雙膜理論
微生物發酵中aaa,通入發酵罐內的空氣中含有的氧不斷溶解於培養液中aaaa,以供菌體細胞代謝之需aaaaa。氧從氣相傳遞到液相aaaaa,是氣一液相間氧的傳遞過程aaaaa,在這一傳遞過程中aaaa,氣液界面的阻力1/KI可以忽略aaa,液體主流中的傳遞阻力1/KLB很小也可忽略aaaa,此時主要的傳遞阻力存在於氣膜和液膜中aaaa。對於這種傳遞過程的描述aaa,應用最廣的是雙膜理論aaaaa。
這個理論假定在氣泡和包圍着氣泡的液體之間存在着界面aaa,在界面的氣泡一側存在着一層氣膜aaaaa,在界面液體一側存在着一層液膜aaaaa,氣膜內的氣體分子與液膜中的液體分子都處於層流狀態aaa,分子之間無對流運動aaaaa,因此氧分子只能以擴散方式aaa,即藉助於濃度差而透過雙膜aaaa,另外aaaaa,氣泡內除氣膜以外的氣體分子處於對流狀態aaa,稱爲氣流主體aaaaa,在空氣主流空間的任一點氧分子的濃度相同aaaa,液流主體亦如此aaaa。
(一)影響氧傳質推動力的因素
要想增加氧傳遞的推動力(C*一CL)aaa,就必須設法提高C*或降低CLaaaaa。
1、提高飽和溶氧濃度C*的方法
A、溫度:降低溫度
B、溶液的性質:一般來說aaaa,發酵液中溶質含量越高aaaa,氧的溶解度越小aaaa。
C、氧分壓:在系統總壓力小於0.5MPa時aaaa,氧在溶液中的溶解度只與氧的分壓成直線關係aaaa。氣相中氧濃度增加aaaa,溶液中氧濃度也增加aaa。
想提高C*就得降低培養溫度或降低培養基中營養物質的含量aaaaa,或提高發酵罐內的氧分壓(即提高罐壓)aaaaa。這幾種方法的實施均有較大的侷限性aaa。已知發酵培養基的組成和培養濃度是依據生產菌種的生理特性和生物合成代謝產物的需要而確定的aaaa,不可任意改動aaaaa。但有時分批發酵的中後期aaaa,由於發酵液粘度太大aaaa,補入部分滅菌水來降低發酵液的表觀粘度aaaaa,改善通氣效果aaaa。採用提高氧分壓的方法aaa,一是提高發酵罐壓力aaa,二是向發酵液通入純氧氣aaa。提高罐壓會減小氣泡體積aaa,減少了氣―液接觸面積aaa,影響氧的傳遞速率aaaaa,降低氧的溶解度aaaaa。影響菌體的呼吸強度aaaa,同時增加設備負擔aaa。通人純氧能顯著提高CLaaaa,但此利方法既不經濟又不安全aaa,同時易出現微生物的氧中毒現象aaaaa。
(2)、降低發酵液中的CL
降低發酵液中的CLaaaa,可採取減少通氣量或降低攪拌轉速等方式來降低KLaaaaaa,使發酵液中的CL降低aaaaa。但是aaa,發酵過程中發酵液中的CL不能低於C臨界aaaa,否則就會影響微生物的呼吸aaa。目前發酵所採用的設備aaa,其供氧能力已成爲限制許多產物合成的主要因素之一aaaa,故此種方法亦不理想aaaaa。
(二)、影響液相體積氧傳遞係數KLa的因素
經過長時間的研究和生產實踐證實aaaaa,影響發酵設備的KLa的主要因素有攪拌效率、空氣流速、發酵液的物理化學性質、泡沫狀態、空氣分佈器形狀和發酵罐的結構等aaaa。實驗測出的KLa與攪拌效率、通氣速度、發酵液理化性質等的關係可用下述的經驗式表示:
KLa=K〔 (P/V)α 〕.(VS)β(ηapp)-ω)
式中 P/V――單位體積發酵液實際消耗的功率(指通氣情況下aaaa,kW/m3)aaaaa;
VS――空氣直線速度aaa,m/haaa;
ηapp――發酵液表觀粘度aaa,(kg・s)/m’aaa;
α、β、ω――指數aaaaa,與攪拌器和空氣分佈器的形式等有關aaaa。
K――經驗常數aaaa。
1、攪拌效率對KLa的影響
發酵罐內裝配攪拌器的作用有:①使發酵罐內的溫度和營養物質濃度均一aaa,使組成發酵液的三相系統充分混合aaa;②把引入發酵液中的空氣分散成小氣泡aaaaa,增加了氣―液接觸面積aaaaa,提高KLa值aaa;⑧強化發酵液的湍流程度aaaa,降低氣泡周圍的液膜厚度和湍流中的流體的阻力aaa,從而提高氧的轉移速率aaaa;④減少菌絲結團aaa,降低細胞壁周圍的液膜阻力aaaaa,有利於菌體對氧的吸收aaa,同時可儘快排除細胞代謝產生的“廢氣”和“廢物”aaa,有利於細胞的代謝活動aaaa。應提出的是如果攪拌速度快aaa,由於剪切速度增大aaaaa,茵絲體會受到損傷aaaa,影響菌絲體的正常代謝aaaa,同時浪費能源aaaa。
2、空氣流速
KLa隨空氣流速的增加而增加aaaa,指數β約爲0.4~0.72aaaa,隨攪拌器形式而異aaaa。但當空氣流速過大時aaaa,攪拌器就出現“氣泛”現象aaaaa,KLa不再增加aaaa。“氣泛”現象指的是在特定條件下aaaa,通人發酵罐內的空氣流速達某一值時aaa,使攪拌功率下降aaa,
當空氣流速再增加時aaa,攪拌功率不再下降aaaaa,此時的空氣流速稱爲“氣泛點”(Floodingpoint)aaaaa。帶攪拌器的發酵罐的氣泛點aaaa,主要與攪拌葉的形式、攪拌器的直徑和轉速、空氣線速度等相關aaaa。
對一定設備而言aaaaa,空氣流速與空氣流量之間呈正相關性aaa。空氣流量的改變必然引起空氣流速的變化aaaaa。已知空氣流速的變化會引起體積氧傳遞係數KLa的改變aaa,當空氣流速達氣泛點時aaaa,KLa不再增加aaaa。這樣aaaa,空氣流量的變化也會改變KLaaaaaa,當空氣流量達某一值時aaa,KLa也不再增加aaa,如圖7-5所示aaaa。所以aaa,在發酵過程中應控制空氣流速(或流量)aaaaa,使攪拌軸附近的液麪處沒有大氣泡逸出aaaaa。
攪拌功率和空氣流速對KLa的影響aaaaa,實驗測出攪拌功率對抗生素產率的影響遠大於空氣流速aaaa。高攪拌轉速aaaaa,不僅使通人罐內的空氣得以充分的分散aaa,增加氣―液接觸面積aaaaa,而且還可以延長空氣在罐內的停留時間aaaa。空流速過大aaaa,不利於空氣在罐內的分散與停留aaaa,同時導致發酵液濃縮aaaa,影響氧的傳遞aaa。但空氣流速過低aaaa,因代謝產生的廢氣不能及時排除等原因aaaaa,也會影響氧的傳遞aaaaa。因此aaa,要提高發酵罐的供氧能力aaaa,採用提高攪拌功率aaaaa,適當降低空氣流速aaa,是一種有效的方法aaaa。
3、發酵液理化性質的影響
KLa與發酵液的表觀粘度ηapp呈反比aaaaa。說明發酵液的流變學性質是影響KLa的主要因素之一aaaaa。發酵液是由營養物質、生長的菌體細胞和代謝產物組成的aaaaa。由於微生物的生長和多種代謝作用使發酵液的組成不斷地發生變化aaa,營養物質的消耗、菌體濃度、菌絲形態和某些代謝產物的合成都能引起發酵液粘度的變化aaaaa,致使發酵過程中的發酵液呈現多種流變學性質aaaaa。
以澱粉作碳源的培養基屬於非牛頓型流體aaaa,在發酵過程中aaa,隨着微生物的生長和代謝作用aaaa,其流變學性質不斷變化aaaa。如生產金黴素時aaa,以澱粉作碳源aaaa,接種時aaa,培養基呈平漢塑性流體性質aaa,發酵至22小時aaaa,由於微生物的代謝作用aaaa,發酵液粘度降至很低(低於18Pa・s)aaaaa,呈現牛頓型流體性質aaaaa。22小時起由於菌絲體濃度不斷增加aaaaa,則發酵液粘度逐漸增大aaa,直至粘度達90Pa・s、表現爲漲塑性流體的性質aaa。
發酵過程中菌體濃度和形態在氧的傳遞速率方面顯示一定影響aaaaa。許多細菌和酵母菌發酵時aaa,發酵液粘度低aaa,呈現牛頓型流體性質aaaa,對氧的轉移沒有什麼影響aaaaa。黴菌和放線菌發酵液多數時間屬於非牛頓型流體aaaa,粘度較大aaaaa,對氧的轉移有較大影響aaaaa。在單細胞和絲狀菌發酵中aaa,對數生長期兩者的氧吸收速率是相同的aaa,但在溶解氧濃度受到限制的條件下aaaa,達到平衡期aaaaa,單細胞發酵液的氧吸收速率無變化aaa,而絲狀菌發酵液的氧吸收速率卻顯著下降aaaaa,其原因是絲狀菌發酵液的菌體濃度增加aaaa,使發酵液粘度不斷增大aaaa,致使KLa值降低aaaa,進而導致菌體的氧吸收速率下降aaaaa。在青黴素發酵中aaa,由於菌絲體濃度的不斷增加aaaaa,使發酵液粘度不斷增大aaaaa,KLa卻隨之下降aaaaa。
在沉沒培養過程中aaaa,由於攪拌的作用aaaa,有的菌體(尤其是黴菌)形成不連續的球狀體aaaa,有的形成交替的絲狀體aaa。一般說aaaaa,球狀體發酵液粘度低aaaa,呈現牛頓型流體性質aaa,而絲狀體會大大增加發酵液的粘度aaa,呈現非牛頓型流體性質aaa。攪拌強度影響菌體形態aaaa,高剪切速率可減少菌絲團的形成aaa,如青黴素發酵中aaaaa,高攪拌速度易使菌體產生分枝菌絲aaaa,低攪拌速度易使菌體形成菌絲團或長成長菌絲aaaaa。
一般說aaa,微生物生物合成的代謝產物對發酵液的流變學性質的影響相對說是較小的aaa。
4、泡沫的影響
在發酵過程中aaa,由於通氣和攪拌而引起發酵液出現泡沫aaa。如果在較稠厚的發酵液中形成流態性泡沫時aaaaa,是難以消除的aaaa,其中的氣體就很難得到及時的更新aaa,直接影響微生物的呼吸aaaaa。如果攪拌葉輪處於泡沫的包圍之中aaa,就會影咆氣液體的充分混合aaaa,降低氧的傳遞速率aaa。用消沫劑可以消除泡沫aaaaa,改善氣液體混合效果aaaa,提高氧的傳遞速率aaaa。但過多的消沫劑會聚集於細胞表面上aaaa,阻礙菌體對氧和營養物質的吸收aaaaa。因此aaaa,消沫劑的用量應控制aaaaa。
5、空氣分佈器形式和發酵罐結構的影響
在需氧發酵中aaa,除用攪拌將空氣分散成小氣泡外aaaa,還可用鼓泡器來分散空氣aaaa,提高通氣效率aaaaa。研究指出aaaa,大型環狀鼓泡器的直徑大於攪拌器直徑時aaaa,大量的空氣未經攪拌器的分散而沿罐壁逸出液麪aaaaa,其空氣分散效果很差aaaaa。所以環型鼓泡器的直徑一定要小於攪拌器的直徑aaaa。關於多孔環狀鼓泡器和單孔式鼓泡器的通氣效果aaa,有的試驗表明aaaaa,當空氣流量達到一定值時aaaaa,單孔式鼓泡器的效果不比多孔環狀鼓泡器的效果差aaaaa。因爲在裝配有攪拌器的發酵罐中aaaa,空氣的分散主要依靠攪拌的作用aaaaa。所以當空氣流量增大時aaa,單孔式鼓泡器能增強發酵液的湍流程度aaa。當前的生產實踐aaaaa,發酵罐內空氣分佈器絕大多數採用多孔環型鼓泡器5aaa。
爲了彌補一般空氣攪拌罐的通氣效率的不足aaaa,有人在設備上做些相應的改進aaaa,當增加發酵罐的高度aaa,以求增加氣―液接觸時間aaa,提高氧的溶解度aaaa。

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