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發酵工藝控制――氧對發酵的影響及控制

2016-07-11 09:31:30車邦

在好氧深層培養中aaa,氧氣的供應往往是發酵能否成功的重要限制因素之一aaaa。通氣效率的改進可減少空氣的使用量aaaa,從而減少泡沫的形成和雜菌污染的機會aaaa。
一、溶解氧對發酵的影響
溶氧是需氧發酵控制最重要的參數之一aaa。由於氧在水中的溶解度很小aaaa,在發酵液中的溶解度亦如此aaa,因此aaaa,需要不斷通風和攪拌aaaaa,才能滿足不同發酵過程對氧的需求aaa。溶氧的大小對菌體生長和產物的形成及產量都會產生不同的影響aaaaa。如穀氨酸發酵aaaaa,供氧不足時aaaaa,穀氨酸積累就會明顯降低aaa,產生大量乳酸和琥珀酸aaaaa。
需氧發酵並不是溶氧愈大愈好aaaaa。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成aaa,但溶氧太大有時反而抑制產物的形成aaaa。因爲aaaa,爲避免發酵處於限氧條件下aaa,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度aaaa,並使發酵過程保持在最適濃度aaaaa。最適溶氧濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關aaaa,這是由實驗來確定的aaa。根據發酵需氧要求不同可分爲三類:第一類有穀氨酸、谷氨醯胺、精氨酸和脯氨酸等穀氨酸系氨基酸aaaaa,它們在菌體呼吸充足的條件下aaaaa,產量才最大aaaa,如果供氧不足aaaaa,氨基酸合成就會受到強烈的抑制aaa,大量積累乳酸和琥珀酸aaaaa;第二類aaaa,包括異亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸aaaa,即天冬氨酸系氨基酸aaa,供氧充足可得最高產量aaaa,但供氧受限aaa,產量受影響並不明顯aaaaa;第三類aaaa,有亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸aaaaa,僅在供氧受限、細胞呼吸受抑制時aaa,才能獲得最大量的氨基酸aaa,如果供氧充足aaaaa,產物形成反而受到抑制aaaaa。
氨基酸合成的需氧程度產生上述差別的原因aaaaa,是由它們的生物合成途徑不同所引起的aaaaa,不同的代謝途徑產生不同數量的NAD(P)Haaaaa,當然再氧化所需要的溶氧量也不同aaa。第一類氨基酸是經過乙醛酸循環和磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統兩個途徑形成的aaaa,產生的NADH量最多aaaa。因此NADH氧化再生的需氧量爲最多aaaaa,供氧愈多aaaa,合成氨基酸當然亦愈順利aaaa。第二類的合成途徑是產生NADH的乙醛酸循環或消耗NADH的磷酸烯醇式丙酮酸羧化系統aaa,產生的NADH量不多aaa,因而與供氧量關係不明顯aaaa。第三類aaa,如苯丙氨酸的合成aaaaa,並不經TCA循環aaaaa,NADH產量很少aaaa,過量供氧aaa,反而起到抑制作用aaaa。肌苷發酵也有類似的結果aaa。由此可知aaa,供氧大小是與產物的生物合成途徑有關
aaaaa。
在抗生素髮酵過程中aaaa,菌體的生長階段和產物合成階段都有一個臨界氧濃度aaaa,分別爲C臨′和C臨aaaa。兩者的關係有:①大致相同aaaaa;②C臨′C臨③C臨′C臨aaaa。
二、微生物對氧的需求
好氧微生物生長和代謝均需要氧氣aaaa,因此供氧必須滿足微生物在不同階段的需要aaa,在不同的環境條件下aaaa,各種不同的微生物的吸氧量或呼吸強度是不同的aaaa。
微生物的吸氧量常用呼吸強度和攝氧率兩種方法來表示aaaaa,呼吸強度是指單位質量的幹菌體在單位時間內所吸取的氧量aaaa,以QO2aaa,表示aaaaa,單位爲mmolO2/(g幹菌體•h)aaaaa。當氧成爲限制性條件時aaaa,比耗氧速率爲:
QO2=(QO2)mCL/(K0+CL)
(QO2)m --------最大比耗氧速度,mol /(kg.s)
K0 --------氧的米氏常數,mol /m3
CL---------- 溶解氧的濃度aaaa, mol /m3
攝氧率是指單位體積培養液在單位時間內的耗氧量aaa,以r表示aaa,單位爲mmolO2/(L•h)aaa。呼吸強度可以表示微生物的相對吸氧量aaaa,但是aaaaa,當培養液中有固體成分存在時aaaaa,對測定有困難aaaaa,這時可用攝氧率來表示aaaaa。微生物在發酵過程中的攝氧率取決於微生物的呼吸強度和單位體積菌體濃度aaaaa。
微生物的比耗氧速率的大小受多種因素影響aaaaa,當培養基中不存在其他限制性基質時aaaaa,比耗氧速率隨溶氧濃度增加而增加aaa,直至某一點aaa,比耗氧速率不再隨溶氧濃度的增加而增加aaaa,此時的溶氧濃度稱爲呼吸臨界氧濃度(criticaloxygenconcentrationOf respiration)aaa,以Ccr表示aaaaa。呼吸臨界溶氧濃度一般指不影響菌體呼吸所允許的最低氧濃度aaaa,如對產物形成而言便稱爲產物合成的呼吸臨界氧濃度aaa。
當不存在其他限制性基質時aaaa,溶解氧濃度高於臨界值aaaa,細胞的比耗氧速率保持恆定aaaa;在臨界氧濃度以下aaa,微生物的呼吸速率隨溶解氧濃度降低而顯著下降aaaaa,細胞處於半厭氣狀態aaa,代謝活動受到阻礙aaaaa。培養液中維持微生物呼吸和代謝所需的氧保持供氧與耗氧的平衡aaaa,才能滿足微生物對氧的利用aaaa。
由此可知aaaaa,只有使溶氧濃度大於其臨界氧濃度時aaaaa,才能維持菌體的最大的比耗氧速率aaaaa,以使菌體得到最大的合成量aaaa。但由於發酵的目的是爲了得到發酵的產物aaaa,因此aaaaa,由氧飢餓而引起的細胞代謝干擾aaa,可能對形成某些產物是有利的aaaa。所以aaaa,需氧發酵並不是溶氧愈大愈好aaaaa。即使是一些專性好氧菌aaaaa,過高的溶氧對生長可能不利aaaaa。氧的有害作用是通過形成新生Oaaa,超氧化物基O2-和過氧化物基O22-或羥基自由基OH-aaaa,破壞許多細胞組分體現的aaaa。有些帶巰基的酶對高濃度的氧敏感aaaa,好氣微生物曾發展一些機制aaaa,如形成觸酶aaa,過氧化物酶和超氧化物歧化酶aaa,使其免遭氧的摧毀aaa。溶氧高雖然有利於菌體生長和產物合成aaaa,溶氧太大有時反而抑制產物的形成aaaaa。爲避免發酵處於限氧條件下aaaa,需要考查每一種發酵產物的臨界氧濃度和最適氧濃度aaaaa,並使發酵過程保持在最適濃度aaaa。最適濃度的大小與菌體和產物合成代謝的特性有關aaaaa,這是由實驗來確定的aaaaa。發酵生產中aaaaa,供氧的多少應根據不同的菌種、發酵條件和發酵階段等具體情況決定aaaaa。
例如穀氨酸發酵在菌體生長期aaaa,希望糖的消耗最大限度地用於合成菌體aaaaa,而在穀氨酸生成期aaaaa,則希望糖的消耗最大限度地用於合成穀氨酸aaaa。因此aaaa,在菌體生長期aaaa,供氧必須滿足菌體呼吸的需氧量aaaaa,即r=Qo2c(X)aaaa,若菌體的需氧量得不到滿足aaa,則菌體呼吸受到抑制aaaaa,而抑制生長aaa,引起乳酸等副產物的積累aaa,菌體收率降低aaaaa。但是供氧並非越大越好aaa,當供氧滿足菌體需要aaaa,菌體的生長速率達最大值aaa,如果再提高供氧aaaaa,不但不能促進生長aaaa,造成浪費aaaaa,而且由於高氧水平抑制生長aaaa。同時高氧水平下生長的菌體不能有效地產生穀氨酸aaa。
三、影響微生物需氧量的因素
在需氧微生物發酵過程中影響微生物需氧量的因素很多aaaaa,除了和菌體本身的遺轉特性有關外aaa,還和下列一些因素有關:
1.培養基
培養基的成分和濃度對產生菌的需氧量的影響是顯著的aaaaa。培養基中碳源的種類和濃度對微生物的需氧量的影響尤其顯著aaaaa。一般來說aaaaa,碳源在一定範圍內aaaa,需氧量隨碳源濃度的增加而增加aaa。在補料分批發酵過程中aaaa,菌種的需氧量隨補入的碳源濃度而變化aaaaa,一般補料後aaa,攝氧率均呈現不同程度的增大aaaaa。
2、菌齡及細胞濃度
不同的生產菌種aaa,其需氧量各異aaa。同一菌種的不同生長階段aaaa,其需氧量也不同aaa。―般說aaaa,菌體處於對數生長階段的呼吸強度較高aaaaa,生長階段的攝氧率大於產物合成期的攝氧率aaaa。在分批發酵過程中aaaa,攝氧率在對數期後期達到最大值aaa。因此認爲培養液的攝氧率達最高時aaaa,表明培養液中菌體濃度達到了最大值aaaaa。
3、培養液中溶解氧濃度的影響
在發酵過程中aaaaa,培養液中的溶解氧濃度(CL)高於菌體生長的臨界氧濃度(C長臨)時aaaa,菌體的呼吸就不受影響aaaa,菌體的各種代謝活動不受干擾aaa;如果培養液中的CL低於C長臨時aaaaa,菌體的多種生化代謝就要受到影響aaaa,嚴重時會產生不可逆的抑制菌體生長和產物合成的現象aaaa。
4、培養條件
若干實驗表明aaa,微生物呼吸強度的臨界值除受到培養基組成的影響外aaa,還與培養液的pH、溫度等培養條件相關aaaa。一般說aaaa,溫度愈高aaa,營養成分愈豐富aaa,其呼吸強度的臨界值也相應增高aaa。
5、有毒產物的形成及積累
在發酵過程中aaaa,有時會產生一些對菌體生長有毒性的如CO2等代謝產物aaa,如不能及時從培養液中排除aaaa,勢必影響菌體的呼吸aaa,進而影響菌體的代謝活動aaaaa。
6、揮發性中間產物的損失
在糖代謝過程中aaa,有時會產生一些揮發性的有機酸aaaaa,它們隨着大量通氣而損失aaaaa,從而影響菌體的呼吸代謝aaa。
四、氧在發酵液中的傳遞
1、氧的傳遞阻力
在需氧發酵過程中aaaa,氣態氧必須先溶解於培養基中aaa,然後纔可能傳遞至細胞表面aaaaa,再經過簡單的擴散作用進入細胞內的呼吸酶的位置上而被利用aaaa,參與菌體內的氧化等生物化學反應aaaa。氧的這一系列傳遞過程需要克服供氧方面和需氧方面的各種阻力才能完成aaaaa。
2、氧的傳遞方程式
(1)雙膜理論
微生物發酵中aaaa,通入發酵罐內的空氣中含有的氧不斷溶解於培養液中aaaa,以供菌體細胞代謝之需aaaa。氧從氣相傳遞到液相aaaaa,是氣一液相間氧的傳遞過程aaaaa,在這一傳遞過程中aaaa,氣液界面的阻力1/KI可以忽略aaaaa,液體主流中的傳遞阻力1/KLB很小也可忽略aaaa,此時主要的傳遞阻力存在於氣膜和液膜中aaaa。對於這種傳遞過程的描述aaa,應用最廣的是雙膜理論aaa。
這個理論假定在氣泡和包圍着氣泡的液體之間存在着界面aaaa,在界面的氣泡一側存在着一層氣膜aaaa,在界面液體一側存在着一層液膜aaa,氣膜內的氣體分子與液膜中的液體分子都處於層流狀態aaaa,分子之間無對流運動aaaa,因此氧分子只能以擴散方式aaaa,即藉助於濃度差而透過雙膜aaa,另外aaa,氣泡內除氣膜以外的氣體分子處於對流狀態aaaaa,稱爲氣流主體aaa,在空氣主流空間的任一點氧分子的濃度相同aaa,液流主體亦如此aaaa。
(一)影響氧傳質推動力的因素
要想增加氧傳遞的推動力(C*一CL)aaa,就必須設法提高C*或降低CLaaaa。
1、提高飽和溶氧濃度C*的方法
A、溫度:降低溫度
B、溶液的性質:一般來說aaaa,發酵液中溶質含量越高aaaa,氧的溶解度越小aaaa。
C、氧分壓:在系統總壓力小於0.5MPa時aaaa,氧在溶液中的溶解度只與氧的分壓成直線關係aaa。氣相中氧濃度增加aaaaa,溶液中氧濃度也增加aaa。
想提高C*就得降低培養溫度或降低培養基中營養物質的含量aaaa,或提高發酵罐內的氧分壓(即提高罐壓)aaaa。這幾種方法的實施均有較大的侷限性aaa。已知發酵培養基的組成和培養濃度是依據生產菌種的生理特性和生物合成代謝產物的需要而確定的aaa,不可任意改動aaaaa。但有時分批發酵的中後期aaa,由於發酵液粘度太大aaa,補入部分滅菌水來降低發酵液的表觀粘度aaaa,改善通氣效果aaaaa。採用提高氧分壓的方法aaaaa,一是提高發酵罐壓力aaa,二是向發酵液通入純氧氣aaaa。提高罐壓會減小氣泡體積aaaa,減少了氣―液接觸面積aaaaa,影響氧的傳遞速率aaaa,降低氧的溶解度aaa。影響菌體的呼吸強度aaaa,同時增加設備負擔aaaa。通人純氧能顯著提高CLaaaa,但此利方法既不經濟又不安全aaaaa,同時易出現微生物的氧中毒現象aaa。
(2)、降低發酵液中的CL
降低發酵液中的CLaaa,可採取減少通氣量或降低攪拌轉速等方式來降低KLaaaaa,使發酵液中的CL降低aaa。但是aaaaa,發酵過程中發酵液中的CL不能低於C臨界aaa,否則就會影響微生物的呼吸aaaaa。目前發酵所採用的設備aaaaa,其供氧能力已成爲限制許多產物合成的主要因素之一aaaa,故此種方法亦不理想aaaaa。
(二)、影響液相體積氧傳遞係數KLa的因素
經過長時間的研究和生產實踐證實aaaa,影響發酵設備的KLa的主要因素有攪拌效率、空氣流速、發酵液的物理化學性質、泡沫狀態、空氣分佈器形狀和發酵罐的結構等aaaa。實驗測出的KLa與攪拌效率、通氣速度、發酵液理化性質等的關係可用下述的經驗式表示:
KLa=K〔 (P/V)α 〕.(VS)β(ηapp)-ω)
式中 P/V――單位體積發酵液實際消耗的功率(指通氣情況下aaa,kW/m3)aaaa;
VS――空氣直線速度aaaaa,m/haaaa;
ηapp――發酵液表觀粘度aaa,(kg・s)/m’aaa;
α、β、ω――指數aaa,與攪拌器和空氣分佈器的形式等有關aaaaa。
K――經驗常數aaa。
1、攪拌效率對KLa的影響
發酵罐內裝配攪拌器的作用有:①使發酵罐內的溫度和營養物質濃度均一aaa,使組成發酵液的三相系統充分混合aaaa;②把引入發酵液中的空氣分散成小氣泡aaaaa,增加了氣―液接觸面積aaaa,提高KLa值aaaa;⑧強化發酵液的湍流程度aaaaa,降低氣泡周圍的液膜厚度和湍流中的流體的阻力aaaa,從而提高氧的轉移速率aaaaa;④減少菌絲結團aaaaa,降低細胞壁周圍的液膜阻力aaaa,有利於菌體對氧的吸收aaaaa,同時可儘快排除細胞代謝產生的“廢氣”和“廢物”aaaaa,有利於細胞的代謝活動aaaa。應提出的是如果攪拌速度快aaaaa,由於剪切速度增大aaaa,茵絲體會受到損傷aaa,影響菌絲體的正常代謝aaaaa,同時浪費能源aaaaa。
2、空氣流速
KLa隨空氣流速的增加而增加aaaa,指數β約爲0.4~0.72aaaa,隨攪拌器形式而異aaa。但當空氣流速過大時aaaaa,攪拌器就出現“氣泛”現象aaa,KLa不再增加aaaa。“氣泛”現象指的是在特定條件下aaaa,通人發酵罐內的空氣流速達某一值時aaaa,使攪拌功率下降aaa,
當空氣流速再增加時aaaaa,攪拌功率不再下降aaaaa,此時的空氣流速稱爲“氣泛點”(Floodingpoint)aaa。帶攪拌器的發酵罐的氣泛點aaaa,主要與攪拌葉的形式、攪拌器的直徑和轉速、空氣線速度等相關aaaa。
對一定設備而言aaaaa,空氣流速與空氣流量之間呈正相關性aaa。空氣流量的改變必然引起空氣流速的變化aaaa。已知空氣流速的變化會引起體積氧傳遞係數KLa的改變aaaa,當空氣流速達氣泛點時aaaa,KLa不再增加aaa。這樣aaa,空氣流量的變化也會改變KLaaaaa,當空氣流量達某一值時aaaaa,KLa也不再增加aaa,如圖7-5所示aaa。所以aaaa,在發酵過程中應控制空氣流速(或流量)aaaa,使攪拌軸附近的液麪處沒有大氣泡逸出aaaaa。
攪拌功率和空氣流速對KLa的影響aaaa,實驗測出攪拌功率對抗生素產率的影響遠大於空氣流速aaaa。高攪拌轉速aaaaa,不僅使通人罐內的空氣得以充分的分散aaaaa,增加氣―液接觸面積aaaa,而且還可以延長空氣在罐內的停留時間aaaa。空流速過大aaa,不利於空氣在罐內的分散與停留aaa,同時導致發酵液濃縮aaaa,影響氧的傳遞aaaaa。但空氣流速過低aaaa,因代謝產生的廢氣不能及時排除等原因aaaaa,也會影響氧的傳遞aaaa。因此aaa,要提高發酵罐的供氧能力aaaaa,採用提高攪拌功率aaaaa,適當降低空氣流速aaaa,是一種有效的方法aaa。
3、發酵液理化性質的影響
KLa與發酵液的表觀粘度ηapp呈反比aaaa。說明發酵液的流變學性質是影響KLa的主要因素之一aaaa。發酵液是由營養物質、生長的菌體細胞和代謝產物組成的aaa。由於微生物的生長和多種代謝作用使發酵液的組成不斷地發生變化aaa,營養物質的消耗、菌體濃度、菌絲形態和某些代謝產物的合成都能引起發酵液粘度的變化aaa,致使發酵過程中的發酵液呈現多種流變學性質aaaaa。
以澱粉作碳源的培養基屬於非牛頓型流體aaaa,在發酵過程中aaaaa,隨着微生物的生長和代謝作用aaa,其流變學性質不斷變化aaaaa。如生產金黴素時aaaa,以澱粉作碳源aaaa,接種時aaa,培養基呈平漢塑性流體性質aaaaa,發酵至22小時aaaaa,由於微生物的代謝作用aaaa,發酵液粘度降至很低(低於18Pa・s)aaaaa,呈現牛頓型流體性質aaaaa。22小時起由於菌絲體濃度不斷增加aaaa,則發酵液粘度逐漸增大aaa,直至粘度達90Pa・s、表現爲漲塑性流體的性質aaa。
發酵過程中菌體濃度和形態在氧的傳遞速率方面顯示一定影響aaaaa。許多細菌和酵母菌發酵時aaaaa,發酵液粘度低aaaa,呈現牛頓型流體性質aaa,對氧的轉移沒有什麼影響aaaaa。黴菌和放線菌發酵液多數時間屬於非牛頓型流體aaa,粘度較大aaaa,對氧的轉移有較大影響aaaa。在單細胞和絲狀菌發酵中aaaa,對數生長期兩者的氧吸收速率是相同的aaaa,但在溶解氧濃度受到限制的條件下aaaa,達到平衡期aaaa,單細胞發酵液的氧吸收速率無變化aaaaa,而絲狀菌發酵液的氧吸收速率卻顯著下降aaaaa,其原因是絲狀菌發酵液的菌體濃度增加aaaa,使發酵液粘度不斷增大aaa,致使KLa值降低aaaa,進而導致菌體的氧吸收速率下降aaaaa。在青黴素發酵中aaa,由於菌絲體濃度的不斷增加aaaa,使發酵液粘度不斷增大aaaa,KLa卻隨之下降aaa。
在沉沒培養過程中aaaa,由於攪拌的作用aaaaa,有的菌體(尤其是黴菌)形成不連續的球狀體aaa,有的形成交替的絲狀體aaaaa。一般說aaaa,球狀體發酵液粘度低aaaaa,呈現牛頓型流體性質aaaa,而絲狀體會大大增加發酵液的粘度aaaaa,呈現非牛頓型流體性質aaaaa。攪拌強度影響菌體形態aaaa,高剪切速率可減少菌絲團的形成aaaa,如青黴素發酵中aaa,高攪拌速度易使菌體產生分枝菌絲aaaa,低攪拌速度易使菌體形成菌絲團或長成長菌絲aaaa。
一般說aaaa,微生物生物合成的代謝產物對發酵液的流變學性質的影響相對說是較小的aaaa。
4、泡沫的影響
在發酵過程中aaaa,由於通氣和攪拌而引起發酵液出現泡沫aaaa。如果在較稠厚的發酵液中形成流態性泡沫時aaaa,是難以消除的aaaaa,其中的氣體就很難得到及時的更新aaa,直接影響微生物的呼吸aaaa。如果攪拌葉輪處於泡沫的包圍之中aaa,就會影咆氣液體的充分混合aaaa,降低氧的傳遞速率aaa。用消沫劑可以消除泡沫aaa,改善氣液體混合效果aaa,提高氧的傳遞速率aaaaa。但過多的消沫劑會聚集於細胞表面上aaa,阻礙菌體對氧和營養物質的吸收aaaa。因此aaa,消沫劑的用量應控制aaaa。
5、空氣分佈器形式和發酵罐結構的影響
在需氧發酵中aaa,除用攪拌將空氣分散成小氣泡外aaaa,還可用鼓泡器來分散空氣aaaaa,提高通氣效率aaaaa。研究指出aaaa,大型環狀鼓泡器的直徑大於攪拌器直徑時aaaaa,大量的空氣未經攪拌器的分散而沿罐壁逸出液麪aaaaa,其空氣分散效果很差aaaa。所以環型鼓泡器的直徑一定要小於攪拌器的直徑aaa。關於多孔環狀鼓泡器和單孔式鼓泡器的通氣效果aaaa,有的試驗表明aaaa,當空氣流量達到一定值時aaa,單孔式鼓泡器的效果不比多孔環狀鼓泡器的效果差aaaa。因爲在裝配有攪拌器的發酵罐中aaa,空氣的分散主要依靠攪拌的作用aaaaa。所以當空氣流量增大時aaaaa,單孔式鼓泡器能增強發酵液的湍流程度aaaa。當前的生產實踐aaaaa,發酵罐內空氣分佈器絕大多數採用多孔環型鼓泡器5aaa。
爲了彌補一般空氣攪拌罐的通氣效率的不足aaaa,有人在設備上做些相應的改進aaaaa,當增加發酵罐的高度aaaaa,以求增加氣―液接觸時間aaa,提高氧的溶解度aaa。

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